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Oct 21, 2023

Fungizid

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8431 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Pilzgattung Alternaria ist ein globaler Krankheitserreger von mehr als 100 Nutzpflanzen und wird mit der sich weltweit ausbreitenden Alternaria-Blattfleckenkrankheit bei Äpfeln (Malus x Domestica Borkh.) in Verbindung gebracht, die zu schwerer Blattnekrose, vorzeitiger Entlaubung und großen wirtschaftlichen Verlusten führt. Bis heute ist die Epidemiologie vieler Alternaria-Arten noch nicht geklärt, da sie saprophytisch, parasitär oder zwischen beiden Lebensstilen wechseln können und auch als primäre Krankheitserreger eingestuft werden, die gesundes Gewebe infizieren können. Wir argumentieren, dass Alternaria spp. wirkt nicht als primärer Erreger, sondern nur als Nekrose-abhängiger Opportunist. Wir haben die Infektionsbiologie von Alternaria spp. untersucht. unter kontrollierten Bedingungen und überwachten die Krankheitsprävalenz in realen Obstgärten und validierten unsere Ideen durch die Anwendung fungizidfreier Behandlungen in dreijährigen Feldexperimenten. Alternaria spp. Isolate waren nicht in der Lage, Nekrosen in gesundem Gewebe auszulösen, sondern nur, wenn zuvor induzierte Schäden vorlagen. Als nächstes reduzierten auf die Blätter aufgetragene Düngemittel ohne fungizide Wirkung Alternaria-assoziierte Symptome (− 72,7 %, SE: ± 2,5 %) bei gleicher Wirksamkeit wie Fungizide. Schließlich wurden niedrige Magnesium-, Schwefel- und Mangankonzentrationen in den Blättern durchweg mit Alternaria-assoziierter Blattfleckenkrankheit in Verbindung gebracht. Das Auftreten von Fruchtflecken korrelierte positiv mit Blattflecken, wurde auch durch Düngemittelbehandlungen reduziert und nahm im Gegensatz zu anderen durch Pilze verursachten Krankheiten während der Lagerung nicht zu. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Alternaria spp. kann eher eine Folge der Blattfleckenkrankheit als deren primäre Ursache sein, da sie offenbar die physiologisch bedingte Blattfleckenkrankheit besiedelt. Unter Berücksichtigung bestehender Beobachtungen, dass eine Alternaria-Infektion mit geschwächten Wirten zusammenhängt, mag der Unterschied geringfügig erscheinen, ist aber von großer Bedeutung, da wir nun (a) den Mechanismus erklären können, wie unterschiedliche Belastungen zur Kolonisierung mit Alternaria spp. führen. und (b) einen grundlegenden Blattdünger durch Fungizide ersetzen. Daher können unsere Erkenntnisse aufgrund des geringeren Einsatzes von Fungiziden zu einer erheblichen Senkung der Umweltkosten führen, insbesondere wenn der gleiche Mechanismus auf andere Nutzpflanzen anwendbar ist.

Die panglobale Gattung Alternaria umfasst saprotrophe Pilze, die für verschiedene Nutzpflanzen pathogen werden können, insbesondere wenn die Wirtspflanzen geschwächt sind und unter Stress stehen1,2,3. Es gibt mehr als 100 Wirtspflanzenarten, darunter wichtige Nutzpflanzen wie Kartoffeln, Tomaten, Weizen, Kohl, Sonnenblumen, Baumwolle, Sojabohnen und Äpfel, bei denen die Pilze typischerweise nekrotische Läsionen hervorrufen4,5,6,7,8. Aufgrund seines breiten Wirtsspektrums gehört Alternaria zu den schädlichsten Krankheitserregern weltweit. Bei Äpfeln (Malus x Domestica Borkh) gehören zu den Alternaria-assoziierten Symptomen Blattflecken und nachfolgende Fruchtflecken und können zu 85 % Entlaubung und bis zu 80 % befallenen Früchten pro Obstgarten führen (ergänzende Abbildung 1), was zu enormen wirtschaftlichen Verlusten führt1,7 ,9,10,11. In Asien gilt es als wirtschaftlich wichtigste Krankheit für den Apfelanbau12,13. Weltweit wird die Apfelproduktion von einigen wenigen Sorten dominiert: „Golden Delicious“, „Red Delicious“, „Fuji“, „Gala“. Diese Top-4-Sorten machen 60,3 % der weltweiten Produktion aus (ohne China, für das die Datenqualität weniger sicher ist, sind es 50,8 %, Daten von 2015), die alle anfällig für Alternaria-Blattflecken sind, was die Auswirkungen der Krankheit verschlimmert14. 15,16. Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass Alternaria spp. kann andere Krankheiten bei Äpfeln hervorrufen, wie z. B. eine schimmelige Kernkrankheit, die sich auf die innere Qualität der Frucht auswirkt und zu erheblichen finanziellen Verlusten für Apfelbauern und -produzenten während der Lagerung nach der Ernte führt10,17,18.

Seit dem ersten Bericht über Alternaria-Blattfleckenkrankheit an Äpfeln im Jahr 1926 (USA) hat sich die Krankheit in den Apfelanbaugebieten auf der ganzen Welt (Asien, Russland, Australien) ausgebreitet, zunächst in Regionen mit trockenem, warmem Klima, einschließlich Südeuropa19, und neuerdings auch gemäßigte Regionen (z. B. Niederlande, 2018)9,11,14,19,20,21,22,23. Für die Entwicklung der Alternaria-Blattfleckenkrankheit sind warme Bedingungen und Hitzeperioden erforderlich. Die ersten Symptome treten typischerweise im Frühsommer auf (Ergänzende Abbildungen 1a und 2). Nachfolgende Regenfälle und Temperaturabfälle im Spätsommer verstärken die Symptome dramatisch (ergänzende Abbildung 1b) und führen zu starker Entlaubung (ergänzende Abbildung 1c) und Fruchtflecken (ergänzende Abbildung 1d)12. Trotz ihrer Bedeutung ist die Epidemiologie von Alternaria am Apfel noch immer wenig verstanden. Folglich ist die Pflanzenschutzstrategie zur Bekämpfung der Alternaria-Krankheit nicht spezifisch und oft nicht wirksam. Als Strategie zur Erntesicherung wenden Landwirte regelmäßig Fungizide durch routinemäßiges Sprühen mit bis zu acht Behandlungen pro Vegetationsperiode an17,24. Die aktuelle Agrarpolitik zielt jedoch darauf ab, den Einsatz von Pestiziden drastisch zu reduzieren (z. B. bis zu 50 % Reduzierung bis 2030; Europäische Kommission), insbesondere weil synthetische Pestizide eine der größten Bedrohungen für Nichtzielorganismen und für die Kontamination von Böden und Böden darstellen Wasser25,26,27,28,29,30. Daher besteht derzeit ein großer Bedarf an alternativen Ansätzen im Pflanzenschutz zur Gewährleistung der Ernährungssicherheit.

Wichtig ist, dass die Symptome der Alternaria-Blattfleckenkrankheit einer wenig bekannten physiologischen Erkrankung des Apfels sehr ähnlich sind, die als „physiologische (oder nekrotische) Blattfleckenkrankheit“ beschrieben wurde13,17,31. Beide Krankheiten zeichnen sich durch ähnliche nekrotische Blattflecken, den gleichen Krankheitsverlauf und ähnliche klimatische Bedingungen aus, die den Krankheitsausbruch begünstigen (siehe auch die ergänzende „Diskussion“: Zwei Krankheiten, gleiche Symptome, Abb. 1a,b). Es wird angenommen, dass physiologische Blattflecken durch ein Ungleichgewicht der Blattnährstoffe verursacht werden, das durch Temperaturabfälle nach Hitzeperioden im Sommer ausgelöst wird13,31. Frühe Studien zeigten, dass zink- und manganhaltige organische Fungizide (Dithiocarbamate) sowie Behandlungen mit Magnesium- und Mangan-Blattdüngern die physiologische Blattfleckenkrankheit reduzieren können32. Im Gegensatz dazu verstärkten Kaliumdünger, ein Antagonist der Magnesiumaufnahme, die Entlaubung33. Diese früheren Untersuchungen konnten jedoch nicht klären, ob und welche Art von Nährstoffungleichgewicht für die Krankheit verantwortlich war, und führten nicht zu einer wirksamen Heilung31,34. Darüber hinaus reduzierten auch Fungizide mit unterschiedlichen Wirkmechanismen (FRAC-Code: 3 und P 09) die physiologische Blattfleckenkrankheit, ein Erreger wurde jedoch nicht identifiziert35,36.

Konzeptionelles Modell, das die bestehende Hypothese zur (Alternaria-)Blatt- und Fruchtfleckenbildung auf Äpfeln und unsere neue Hypothese, eine Synthese, den Alternaria-Komplex, beschreibt. Es gibt zwei bestehende Hypothesen für die Entstehung derselben Symptome: (A) die Erregerhypothese für Alternaria-Blattflecken (biotisch) und (B) die physiologische Blattflecken-Hypothese (abiotisch). Wir schlagen eine Synthese beider (C) des Alternaria-Komplexes vor. Umwelteinflüsse führen zu Nährstoffungleichgewichten mit der Bildung von Blattflecken (Ci), die anschließend von Alternaria spp. besiedelt werden können. (C-ii). Auch andere Faktoren wie die Phytotoxizität von Wirkstoffen und Rote Milben können die notwendigen Voraussetzungen für Alternaria spp. bilden. Kolonisierung (C-iii). Ein unbekannter Auslöser kann die saprophytische Lebensform in eine pathogene Lebensform (Toxinproduktion) von Alternaria spp. verwandeln, mit der Folge einer Verstärkung der typischen Symptome. Ähnliches gilt für die Fruchtfleckenbildung (D). Vorgeschädigte Lentizellen sind zwingende Voraussetzung für die Besiedelung durch Alternaria spp. mit den daraus resultierenden Symptomen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ursachen für Alternaria-Blattflecken, physiologische Blattflecken und Fruchtflecken kaum bekannt sind. Darüber hinaus stehen die bisherigen Hypothesen im Widerspruch zu den vorhandenen Erkenntnissen: Wenn Blattflecken ausschließlich durch Alternaria spp. verursacht würden. Wenn es sich um eine Infektion handelt, sollte es nicht durch Blattdünger beeinträchtigt werden, da diese keine fungizide Wirkung haben. Und wenn Nährstoffungleichgewichte die einzige Ursache wären, warum reduzieren dann Fungizide mit unterschiedlichen Wirkungsweisen die Schwere der Blattfleckenkrankheit? Angesichts der Ähnlichkeit der Symptome schlagen wir eine neue Synthese vor. Wir gehen davon aus, dass es sich bei der physiologischen Blattfleckenkrankheit und der Alternaria-Blattfleckenkrankheit um zwei miteinander verbundene Krankheiten handelt: den Alternaria-Komplex. Eine anfängliche Blattnekrose, die durch Nährstoffungleichgewichte bei Apfelbäumen verursacht wird (wie in Abb. 1c dargestellt), ist eine notwendige Voraussetzung für die anschließende Besiedlung durch Alternaria spp., die wiederum die Schwere der Krankheit verschlimmern kann.

Wir gehen davon aus, dass (1) unterschiedliche Blattnährstoffsignaturen mit der Krankheit verbunden sind, (2) dass Alternaria spp. gesundes Apfelgewebe ohne bereits bestehende Nekrosen nicht infizieren kann und (3) dass Alternaria-assoziierte Krankheiten durch die Verhinderung anfänglicher Blattnekrosen durch Blattdüngung bekämpft werden können.

Wir untersuchten die Entwicklung der Blattfleckenkrankheit in Apfelplantagen in Südtirol (Italien), wo die Blattfleckenkrankheit ab 1999 zunehmend vorherrschte. Um herauszufinden, welche Blattnährstoffe den anfänglichen Blattfleck verursachen könnten, verknüpften wir die Blattnährstoffkonzentrationen (N, P, K, Ca, Mg, S, B, Fe, Mn, Cu und Zn) mithilfe der Random-Forest-Analyse mit dem Schweregrad des Blattfleckens ( Für eine detaillierte Analyse siehe Ergänzende Ergebnisse S1, Ergänzende Abbildungen 4–6, Ergänzende Tabelle 5).

Die Daten wurden von ausgewachsenen Bäumen der Apfelsorten „Golden Delicious“ und „Cripps Pink“ gewonnen, die anfällig für Alternaria spp. sind, und wurden in unserem unten beschriebenen Feldversuch verwendet. Den Prädiktoren zufolge waren niedrige Schwefelkonzentrationen bei beiden Sorten durchgängig mit einer stärkeren Blattfleckenbildung verbunden (Abb. 2a). Allerdings waren Schwefel und Magnesium im Datensatz stark kollinear (r = 0,78, ergänzende Abbildung 4), und wir können eine mögliche Rolle von Magnesium nicht ausschließen, auch wenn die Modellauswahl (basierend auf AIC) Schwefel als treibendes Element stark unterstützte (ergänzende Ergebnisse). S1). Darüber hinaus waren niedrige Mangankonzentrationen auch mit einem hohen Schweregrad der Blattfleckenbildung verbunden, jedoch nur bei „Golden Delicious“ (Abb. 2b). Um diese Ergebnisse anhand unabhängiger Daten zu validieren, verglichen wir den Blattnährstoffstatus in gepaarten „Golden Delicious“-Obstgärten im Untersuchungsgebiet mit entweder hoher oder niedriger Blattfleckeninzidenz in früheren Jahren. Diese Analyse zeigte, dass Obstgärten mit hoher Inzidenz tatsächlich mit niedrigen Schwefel-, Magnesium- und insbesondere Mangankonzentrationen in den Blättern verbunden waren (Ergänzende Ergebnisse S2, Ergänzende Abbildungen 7 und 8).

Zusammenhänge zwischen dem Schweregrad der Blattfleckenbildung und den Nährstoffkonzentrationen in den Blättern. Ein signifikanter Zusammenhang wurde für Schwefel (a) und Mangan (b) gefunden. Beachten Sie, dass der Blattfleck im logarithmischen Maßstab aufgetragen ist. Für die Apfelsorten „Golden Delicious“ (orange) und „Cripps Pink“ (rosa) waren separate Linien geeignet. Dicke farbige Linien zeigen die angepasste Regression, gepunktete Linien die SEs. Die grauen gepunkteten Linien dienen nur als visuelle Hilfe. Eine detaillierte Analyse finden Sie in den Ergänzenden Ergebnissen S1.

Als nächstes untersuchten wir die Infektionsbiologie der Alternaria-Krankheit. Wir haben unter kontrollierten Bedingungen getestet, ob Alternaria spp. kann gesundes oder verletztes Blatt- und Fruchtgewebe infizieren. Zunächst wurde ein Blattscheibentest mit einer Sporensuspension (1,25 × 106 Sporen/ml) von vier verschiedenen Alternaria-Arten durchgeführt. Isolate (zwei A. alternata sspp. tenuissima und zwei A. alternate sspp. arborescens, wie von Armitage et al. 2015 klassifiziert), die ursprünglich aus Blattflecken und Fruchtflecken auf Äpfeln isoliert wurden. Dieser Test führte jedoch weder bei gesundem Gewebe noch bei manuell mit einer Zange beschädigten Blattscheiben zu einer Blattnekrose (ergänzende Abbildung 9; ergänzende Tabelle 7). Wir fanden keine Hinweise auf eine Infektion (Gelbfärbung oder Bräunung der Blattepidermis), obwohl die Isolate ein dichtes Myzel auf der Oberfläche der Blattscheibe entwickelten (ergänzende Abbildung 1f). Erst wenn die Blätter zuvor von der Roten Milbe (Panonychus ulmi; saugende und blattschädigende Wirkung) befallen und beschädigt wurden, kam es zur Bildung von Nekrosen (Ergänzende Abbildung S9).

In einem zweiten Labortest haben wir Apfelfrüchte künstlich mit einer dichten Sporensuspension von Alternaria spp. inokuliert. (A. alternata sspp. arborescens; 1,25 × 106 Sporen/ml), die ursprünglich aus infizierten Früchten isoliert wurde. Nach 12 Tagen in der Klimakammer (25 °C) konnten wir weder Fruchtflecken noch Anzeichen einer Infektion (nekrotische Flecken, Schimmel) feststellen (Ergänzung Abb. 10). Dies traf auch zu, wenn Äpfel frische, nicht nekrotische Wunden aufwiesen, die laut Literatur eine Infektion begünstigen sollten7. In einem dritten Versuch untersuchten wir, ob sich Anzahl und Größe der Fruchtflecken während der Lagerung (Raumtemperatur, ~ 15–20 °C) vergrößern können. Zu diesem Zweck wurden infizierte und gesunde Früchte zwei Monate lang gemeinsam in Kisten mit Oberflächenkontakt gelagert. Dabei entwickelten gesunde (Kontroll-)Früchte keine Fruchtflecken und die Anzahl der Fruchtflecken auf infizierten Früchten veränderte sich während der Lagerung nicht (Ergänzende Abbildung 11). Daher nahmen Anzahl und Größe der Fruchtflecken während der Lagerung nicht zu.

Zusammenfassend ergab unsere Studie, dass unsere Alternaria-Isolate (A. alternata sspp. tenuissima und A. alternative sspp. arborescens) unter kontrollierten Bedingungen weder gesundes Gewebe oder frische Wunden infizieren noch die Blattsymptome reproduzieren konnten Flecken und Fruchtflecken weder in den Blättern noch in den Früchten.

Um die Rolle der Blattnekrose bei Alternaria spp. zu untersuchen. Aufgrund dieses Vorkommens führten wir im Juli 2019 einen Feldversuch mit „Golden Delicious“-Bäumen durch. Wir induzierten Blattflecken mit einem Herbizid (Carfentrazone-ethyl) und untersuchten, ob dies zum Auftreten von Alternaria spp. führte. Im September war die Dichte der Alternaria-Sporen auf den herbizidinduzierten Blattflecken im Durchschnitt 14-mal höher als auf dem natürlich vorkommenden Alternaria-Blattflecken (Ergänzungsabbildung 12). Im Oktober hatte die Sporendichte auf natürlichen Alternaria-Blattflecken zugenommen, war jedoch immer noch erheblich (2,7-fach) niedriger als auf herbizidinduzierten Blattflecken (Ergänzungstabelle 8), was darauf hindeutet, dass bereits vorhandene Nekrosen eine wichtige Voraussetzung dafür sind Kolonisierung und dass Alternaria spp. Anschließend folgt die Ausbreitung der Nekrose.

Um unsere Hypothese zu bestätigen, führten wir ein dreijähriges Feldexperiment in Apfelplantagen durch. Auf ausgewachsenen Bäumen der Sorten „Golden Delicious“ und „Cripps Pink“ haben wir üblicherweise entweder maßgeschneiderte Blattdünger auf Schwefelbasis ohne fungizide Wirkung angewendet (getestet mit In-vitro-Screening auf fungizide Aktivität, Ergänzungstabelle 1, Ergänzungsabbildung 15). verwendete Fungizide oder keines von beiden (Kontrolle) unter konventioneller („integrierter Produktion“) Anbaupraxis. Über drei Jahre reduzierten die Blattdünger die Alternaria-Blattfleckenbildung bei beiden Apfelsorten um durchschnittlich 72,7 % (SE: ± 2,5) (Abb. 3, p < 0,001; Ergänzungstabelle 2). Diese Reduzierung war die gleiche wie bei häufig verwendeten Fungiziden (72,7 %, SE: ± 3,3). Die schwefelbasierten Blattdünger reduzierten auch Fruchtflecken auf „Golden Delicious“ (50,2 %, SE: ± 7,3, p < 0,001, Ergänzungstabelle 3), während die Fungizide im Durchschnitt zu einer Reduzierung um 75,9 % (SE: ± 4,6) führten (Abb. 3, p <0,001; Ergänzungstabelle 2). Im Gegensatz dazu waren Fruchtflecken bei „Cripps Pink“ selten (111-fach geringeres Vorkommen als bei „Golden Delicious“) und eine reduzierende Wirkung von Blattdüngern auf Fruchtflecken konnte nicht festgestellt werden (p = 0,721). Für „Golden Delicious“ fanden wir in allen drei Jahren eine positive Korrelation zwischen Blattflecken und Fruchtflecken (r = 0,53 bis 0,78, Ergänzungsabbildung 3; Ergänzungstabelle 4).

Relative Reduzierung von Alternaria-assoziierten Blattflecken und Fruchtflecken durch Fungizide oder schwefelhaltige Blattdünger (SBF). Dargestellt sind die Fungizid- und SBF-Wirksamkeit bei den beiden Apfelsorten „Golden Delicious“ (orange; Dünger: Sulfat-Mix) und „Cripps Pink“ (Pink Lady®; rosa; Dünger: mikrofeiner Schwefel) im Vergleich zur herkömmlichen Praxis (Kontrolle, gepunktet). Linie bei Null). Der Feldversuch wurde in einem randomisierten Blockdesign (n = 4 pro Behandlung) von 2017 bis 2019 am Forschungszentrum Laimburg, Südtirol, Italien, durchgeführt. Die Reduzierung der Blattflecken war bei beiden Sorten über alle Jahre hinweg signifikant (p < 0,0001, Ergänzungstabelle 2), während die Reduzierung der Fruchtflecken nur bei „Golden Delicious“ signifikant war (Ergänzungstabelle 3). Fruchtflecken auf „Cripps Pink“ waren sehr selten bis gar nicht vorhanden (Kontrolle: mittlere Anzahl der Flecken Frucht-1 ± SE: 0,0092 ± 0,0049; siehe ergänzende Abbildung 14), was es ungeeignet machte, relative Reduzierungen zu berechnen.

Basierend auf unserer Studie haben wir Beweise gefunden, die die weit verbreitete Annahme in Frage stellen, dass Alternaria spp. ist die primäre und direkte Ursache für Alternaria-Blattflecken bei Äpfeln und lässt darauf schließen, dass die Krankheit komplexer ist als bisher angenommen. Unsere Ergebnisse widersprechen der Vorstellung, dass der Pilz als primärer Krankheitserreger fungiert, da die künstliche Inokulation von gesundem Gewebe fehlschlug und sich die Fruchtflecken während der Lagerung nicht vergrößerten. Darüber hinaus beobachteten wir einen starken Zusammenhang zwischen niedrigen Nährstoffkonzentrationen in den Blättern und dem Auftreten von Krankheiten.

Darüber hinaus hat unsere Studie gezeigt, dass einfache Blattdünger auf Schwefelbasis, die das Pilzwachstum nicht hemmen, Alternaria-Blattflecken mit der gleichen Wirksamkeit wie Fungizide reduzieren können. Da die Düngemittel den physiologischen Zustand der Pflanze stärken und nicht direkt auf den Pilz einwirken, schlagen wir vor, dass sie die primäre Ursache der Krankheit behandeln und dass eine Alternaria-Infektion ein sekundäres Symptom darstellt. Auf dieser Grundlage schlagen wir die neue Synthese vor, dass die physiologische Blattfleckenkrankheit und die Alternaria-Blattfleckenkrankheit keine unterschiedlichen Krankheiten sind, sondern vielmehr Teil eines Kontinuums, das wir den „Alternaria-Komplex“ nennen. Dieses Kontinuumskonzept erkennt die multifaktorielle Natur der Krankheitsauslösung und -proliferation an und unterstreicht die Bedeutung der Berücksichtigung sowohl der physiologischen als auch der Pilzfaktoren, die an der Krankheitsentwicklung beteiligt sind (Abb. 1).

Wir argumentieren, dass die allgegenwärtigen Alternaria-Sporen jede bereits bestehende Blattnekrose besiedeln und diese Nekrosen nicht selbst auslösen können. Stattdessen werden die anfänglichen Blattflecken hauptsächlich durch ein Ungleichgewicht der Blattnährstoffe verursacht (Abb. 1c-i). Allerdings können anfängliche Blattnekrosen auch durch andere Mechanismen entstehen, z. B. können bestimmte Wirkstoffe, die bei bestimmten Wetterbedingungen versprüht werden, phytotoxische Wirkungen haben (Abb. 1c-ii)37,38,39. Unabhängig von der Ursache der anfänglichen Blattflecken besiedeln und vergrößern die allgegenwärtigen Alternaria-Sporen anschließend die vorhandenen Nekrosen (Abb. 1c-iii), möglicherweise durch die Freisetzung von Toxinen (z. B. Alternariol, Altenuen, Tenuazonsäure), was zu einer vorzeitigen Entlaubung führt und Ertragsverlust 40,41,42,43,44. Der gleiche Mechanismus gilt wahrscheinlich für die Bildung von Fruchtflecken, und nur vorgeschädigte Lentizellen können von Alternaria spp. besiedelt werden. (Abb. 1d). Diese opportunistische pathogene Rolle von Alternaria spp. im Krankheitsverlauf erklärt, warum verschiedene Fungizide auch die Symptome an Blättern und Früchten reduzieren, eine primäre Alternaria-Infektion jedoch nicht die ursprüngliche Ursache ist.

Diese Synthese stellt eine deutliche Verbesserung gegenüber den ursprünglichen konkurrierenden Hypothesen dar, da sie eine umfassende Erklärung für die inkonsistenten und komplexen Ergebnisse im Zusammenhang mit der Alternaria-Krankheit liefert (siehe Ergänzung „Diskussion: Zwei unzureichende Hypothesen“).

Wir möchten anerkennen, dass unsere Infektionsexperimente unter kontrollierten Bedingungen und mit einer begrenzten Anzahl von Isolaten durchgeführt wurden und daher nur einen Bruchteil der möglichen Wechselwirkungen zwischen Alternaria spp. und die Wirtspflanze Apfel. Darüber hinaus bestehen erhebliche Schwankungen in den Ergebnissen anderer Infektionsexperimente mit Alternaria spp., wobei einige Studien von fehlgeschlagenen künstlichen Impfungen ohne Symptome oder Inkonsistenzen berichteten14,45,46,47, während andere von einer erfolgreichen Impfung mit Symptomen berichteten15,48,49. 50. Die variable Pathogenität (erfolgreiche vs. fehlgeschlagene Infektion) von Alternaria spp. wird typischerweise durch „Pathotypen“ von Alternaria-Stämmen, insbesondere A. alternata, erklärt, die verschiedene Metaboliten wie wirtsspezifische Toxine produzieren können, die als Virulenzfaktoren oder Kolonisierungsfaktoren wie Tenuazonsäure und Alteraniol wirken41,42,51,52. Diese Toxine können innerhalb von Stunden Zelltod und Nekrose auslösen, wenn sie direkt auf Pflanzengewebe aufgetragen werden40,44,53. Leider wurde unsere Studie zur künstlichen Inokulation ohne metabolische Charakterisierung der verwendeten Isolate durchgeführt, und das Scheitern der Inokulation könnte auf eine geringere Virulenz dieser Isolate zurückzuführen sein54.

Angesichts des aktuellen Stands der Alternaria-Forschung halten wir es für wichtig, den Schwerpunkt auf Toxine und Toxizitätstests zu überdenken, insbesondere im Hinblick auf die Charakterisierung der Virulenz bei Alternaria spp. und für die Erfüllung von Kochs Postulaten. Wir glauben, dass eine kritische Prüfung dieser Methode notwendig ist, um eine genaue Interpretation der Infektionsbiologie von Alternaria spp. zu gewährleisten. In „Bioassays mit abgelösten Blättern“ oder „Pathogenitäts-Bioassays“ wird dieser direkte Toxineffekt genutzt, um auf die Pathogenität (Pathotyp vs. Nicht-Pathotyp) von Alternaria-Stämmen zu schließen9,55,56. Dennoch können diese Tests einige Herausforderungen mit sich bringen, da sie (a) den biologischen Prozess der Infektion, d. Dies liegt daran, dass Pathogenitätstests typischerweise an verletztem Gewebe durchgeführt werden, manchmal mit den gereinigten Toxinen und ohne den Pilz9,23,40,42,48,53,55,57. Darüber hinaus (b) unterscheiden sich die in diesen Tests hervorgerufenen Blattnekrosen (Venennekrose, ausgedehnte Nekrose) symptomatisch stark von Blattflecken im Feld (konzentrische Flecken)45,46,55,56,58. Schließlich (c) bleiben diese Nekrosen in ihrer Größe konstant und vergrößern sich nicht, wenn Myzelpfropfen als Inokulum verwendet wurden47,48. Insgesamt ist es wichtig zu erkennen, dass Pathogenitätstests Grenzen haben, wenn es darum geht, festzustellen, ob Alternaria spp. kann Wirtspflanzen effektiv infizieren. Darüber hinaus ist anzumerken, dass es keine eindeutigen Hinweise auf eine Primärinfektion (dh das Eindringen von Hyphen in gesundes Gewebe) durch Alternaria spp. gibt. auf Apfelpflanzen. Die Unterschiede zwischen „Toxineffekt“, „Infektion“, „Sekundärerreger“ und „Primärerreger“ mögen subtil erscheinen, aber um eine unwirksame Behandlung zu vermeiden, ist es von grundlegender Bedeutung, die Infektionsbiologie eines Krankheitserregers zu verstehen. Bei Alternaria hat die derzeitige Praxis zu einer Fehlklassifizierung eines opportunistischen sekundären Krankheitserregers als primären Krankheitserreger geführt, was zu einer unnötigen und unspezifischen Behandlung mit Fungiziden führte.

Wichtig ist, dass eine starke Analogie zwischen der „Alternaria-Krankheit“ bei Äpfeln und der „Alternaria-Krankheit“ bei anderen Nutzpflanzen besteht. Auf Kartoffeln werden Sporen von Alternaria solani, von denen angenommen wird, dass sie die Frühfäule verursachen, hauptsächlich auf abgestorbenen oder absterbenden Blättern produziert7. Darüber hinaus wird Frühfäule auch mit Hitzestress und Nährstoffmangel in Verbindung gebracht59,60. Bei mehreren Nutzpflanzen zeigten Fungizidbehandlungen nur eine geringe Wirksamkeit, während die Anwendung von Magnesium (Kartoffel, Mohn) und Zink (Tomate) die Frühfäule bekämpfte, was darauf hindeutet, dass hier möglicherweise ein ähnlicher physiologischer Mechanismus wie bei Äpfeln wirksam ist. Ebenso reduzierte die Blattanwendung von MgSO4 auf Mohn die Schwere der Erkrankung verschiedener Schimmelpilze, einschließlich Alternaria Brassicae f. somniferi61. Für Baumwolle wurde gezeigt, dass Kältestress der wichtigste prädisponierende Faktor für eine Infektion mit A. alternata ist3. Zusammenfassend haben mehrere Studien gezeigt, dass Alternaria mit Nährstoffmangel zusammenhängt oder dass der Befall mit Düngemitteln kontrolliert werden kann62,63,64,65,66,67, aber auch andere Belastungen stehen mit Alternaria spp. in Zusammenhang, wie Trockenheit, Seneszenz, Viren- und Insektenschäden oder Kältestress 3,7,68,69,70,71. Daher können verschiedene abiotische und biotische (z. B. Milben in unseren Ergebnissen) Pflanzenstress eine Kolonisierung durch Alternaria spp. auslösen. auch in anderen Pflanzen.

Der Verein Alternaria spp. gegenüber verschiedenen Arten von Stress wird normalerweise durch eine höhere Anfälligkeit aufgrund eines „geschwächten“ Wirts erklärt2,7. Der Begriff „geschwächt“ bezieht sich jedoch auf verschiedene Veränderungen in physiologischen Prozessen, beispielsweise auf Stressreaktionsmechanismen 72,73,74. Die „geschwächte“ Wirtshypothese impliziert auch, dass dann eine Infektion oder das Eindringen von frischem Pflanzengewebe stattfinden kann, was nicht mit der saprophytischen Lebensweise von Alternaria spp.1,2,7 vereinbar ist. Im Gegensatz dazu nehmen wir an, dass abgestorbenes Pflanzengewebe die Schlüsselvoraussetzung für die Kolonisierung von Alternaria spp. ist. auf Apfel und wahrscheinlich auch für andere Pflanzen. Die neue Hypothese erklärt, warum mit Alternaria spp. eine Vielzahl verschiedener Belastungen verbunden ist: Alle diese Belastungen führen zu Nekrosen, die anschließend von Alternaria spp., einem vorwiegend saprophytischen Pilz, besiedelt werden können.

Wir sind uns der multifaktoriellen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Alternaria-Arten, verschiedenen Wirtspflanzen und verschiedenen Sorten bewusst. Obwohl wir nicht alle anfälligen Sorten getestet haben, glauben wir, dass unsere Ergebnisse repräsentativ sind, da die meisten dieser Sorten genetisch verwandt sind und die Krankheitsdynamik wahrscheinlich ähnlich ist. Andererseits konzentriert sich ein großer Teil der Forschung auf die „Pathogenität“ verschiedener Alternaria-Arten/-Isolate (Pathotypen), indem sie sich auf die produzierten Toxine oder die damit verbundenen Genloci6,44,75,76,77,78 konzentriert. Es wurden zahlreiche Alternaria-Phytotoxine beschrieben, und kürzlich wurde ein neues mutmaßliches Toxin entdeckt, das in 14 verschiedenen Isolaten produziert wird44,79. Das neue Toxin war nicht mit bekannten Alternaria-Toxin-Genregionen (AMT1, AMT4, AMT14) verwandt, was die Komplexität der Forschung zur Alternaria-Pathogenität begründet. Wir argumentieren jedoch, dass die Pathotyp-Typologie und ihr Potenzial zur Produktion von Toxinen nicht erklären können, warum Fungizide und Düngemittelbehandlungen die Symptome gleichermaßen reduzierten. Dies würde bedeuten, dass alle verschiedenen Arten von Düngemitteln und Nährstoffen (siehe Referenzen oben; N, P, K, Mg, Zn, S, Mn) mehrere und hochwirksame Toxine „inaktivieren“ können (Nekrose innerhalb weniger Stunden), deren Zell- Es wird angenommen, dass die schädigende Wirkung der Schlüsselprozess für eine Infektion ist 40,41,80,81 (siehe auch Ergänzung „Diskussion“).

Obwohl die eigentlichen Ursachen für das Ungleichgewicht der Blattnährstoffe weiter untersucht werden müssen, wurden klimatische Faktoren und insbesondere Hitzewellen und anschließende Temperaturabfälle als Hauptursachen in Betracht gezogen17,31. Steigende Temperaturen und eine zunehmende Häufigkeit von Hitzeperioden und Wetterextremen in der Untersuchungsregion stehen im Einklang mit der zunehmenden Häufigkeit und räumlichen Verteilung (beschränkt auf heiße Talböden) von Alternaria-Blattflecken und dem ersten Auftreten von Fruchtflecken vor 22 Jahren (im Jahr 1999). 82. Darüber hinaus deutet die anhaltende Ausbreitung der Blattfleckenkrankheit auf Regionen mit (weniger warmen) gemäßigten Klimazonen darauf hin, dass der Klimawandel ein wesentlicher Treiber ist 23. Allerdings sind die umweltbedingten und physiologischen Mechanismen, die für die geringe Verfügbarkeit, Aufnahme, Auswaschung oder Sequestrierung von Mn, S und Mg verantwortlich sind, nach wie vor unzureichend verstanden. Ein variabler Zustand des Bodenwassers (Dürre oder Staunässe) und unausgewogene Bewässerungssysteme können potenzielle Treiber sein, da sie die Verfügbarkeit von Nährstoffen, insbesondere Mangan, stark beeinflussen 35. Wichtig ist, dass der Alternaria-Komplex tatsächlich durch durch den Klimawandel verursachte Wetterextreme angetrieben wird Die Bedeutung für den Apfelanbau dürfte in naher Zukunft deutlich zunehmen.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass Alternaria spp. ist nicht die Hauptursache für Alternaria-Blattflecken und Fruchtflecken, sondern ein opportunistischer Erreger. Alternaria spp. besiedelt nur bereits vorhandenes nekrotisches Gewebe von Apfelblättern und -früchten. Diese vorbestehenden Nekrosen werden durch eine physiologische Nährstoffstörung (beteiligt an S, Mn und Mg) verursacht und treten zunächst als physiologische Blattfleckenbildung auf. Aber auch andere Ursachen (z. B. Rote Vogelmilbe, Phytotoxizität von Wirkstoffen) können initiale Nekrosen auslösen und somit eine Voraussetzung für die Besiedelung durch Alternaria spp. darstellen. Schließlich haben wir gezeigt, dass schwefelbasierte Blattdünger als einfache vorbeugende Methode zur Bekämpfung von Alternaria-assoziierten Krankheiten eingesetzt werden können. Der Einsatz dieser Blattdünger kann den weltweiten Fungizideinsatz im Apfelanbau deutlich reduzieren. Die potenziellen Auswirkungen werden sich noch deutlich verschärfen, wenn die gleichen Mechanismen, wie wir vermuten, auch bei anderen Nutzpflanzen auftreten und ebenfalls durch eine Behandlung mit Blattdünger behandelt werden können.

Alle Feldversuche wurden von 2017 bis 2019 in den Apfelplantagen des Versuchszentrums Laimburg, Südtirol, Italien (224 m ü. M.; 46,3825°/11,2887°) durchgeführt. Wir haben unsere Experimente in zwei Blöcken aufgebaut, dem „Golden Delicious“-Block (gepflanzt 2012) und dem „Cripps Pink“ („Pink Lady®“)-Block (gepflanzt 2000). Reihen reifer Apfelbäume waren von Norden nach Süden ausgerichtet und wuchsen als schlanke, spindelförmige Bäume mit einer Höhe von 3,5 m. Wir haben die Experimente als randomisiertes Blockdesign mit 4 Wiederholungen aufgebaut, wobei eine Reihe einen Block darstellt. Um den Einfluss benachbarter Behandlungen zu minimieren, haben wir zwei „Pufferreihen“ zwischen den Blöcken eingebaut. Die Parzellen innerhalb eines Blocks bestanden aus 15 aufeinanderfolgenden Bäumen. Die ersten drei und die letzten drei Bäume einer Parzelle, die an die anderen Parzellen grenzen, wurden bei der Bewertung nicht berücksichtigt.

Zur Auswertung der Behandlungen (siehe unten) wurden Früchte und Blätter während der üblichen Ernteperioden gesammelt (Golden Delicious: 19. Sept. 2017, 19. Sept. 2018, 26. Sept. 2019; 'Cripps Pink': 7. Nov. 2017, 8. Nov. 2018, 15. Nov. 2019). Von jeder Parzelle haben wir nach dem Zufallsprinzip zwei Kisten Äpfel (ca. 50–65 Äpfel pro Kiste) gesammelt, eine für jede Baumseite (West und Ost). Die Früchte wurden sofort bis zur weiteren Auswertung in die Kühlzelle (2,5 °C und 90 % relative Luftfeuchtigkeit) überführt. Am selben Tag wurden zufällig Blätter von denselben Bäumen gesammelt, 100 Blätter pro Parzelle (Replikation), gleichmäßig über die Baumseiten verteilt (50 Blätter pro Seite) und in Papiertüten gesteckt. Zur Quantifizierung der „Alternaria“-Blattfleckenkrankheit wurde jedes Blatt im Labor visuell analysiert und einer Befallsklasse zugeordnet, die dem prozentualen nekrotischen Bereich eines Blattes entspricht (0 %, 0–5 %, 5–10 %, 10–15 %, 15–20 %, 20–30 %, > 30 %). Die Früchte wurden auch Befallsklassen zugeordnet, wobei die Anzahl der erkannten Fruchtflecken pro Apfel berücksichtigt wurde (0, 1–2, 3–5, > 5). Die Ergebnisse wurden für jede Parzelle zusammengefasst und repräsentierten ein Replikat/einen Datenpunkt. Fruchtflecken traten bei der Fungizidbehandlung von „Cripps Pink“ nahezu nicht auf und wurden daher nicht bewertet.

Die Bewirtschaftung der Obstgärten erfolgte nach den Richtlinien des integrierten Kernobstanbaus mit der Ausnahme, dass keine Düngemittel und keine spezifischen Alternaria-Wirkstoffe ausgebracht wurden83. Somit stellen unsere Kontrollparzellen eine integrierte Bewirtschaftung ohne spezifische Alternaria-Behandlungen dar, während es sich bei den anderen Versuchsparzellen um eine integrierte Bewirtschaftung plus entsprechende experimentelle Behandlung handelte. Die getesteten Behandlungen wurden auf der Grundlage früherer Ergebnisse und Feldbeobachtungen entwickelt (siehe ergänzende Abbildung 13). Unsere Behandlung gegen Alternaria-Blattflecken war für Golden Delicious die Sulfatmischung (SBF, Zusammensetzung siehe Ergänzungstabelle 1). Für „Cripps Pink“ verwendeten wir 2017 die Schwefelsuspension Thiopron® (UPL Italia srl; 2017: 0,605 l/hl = 500 g S/hl). Da Thiopron® entgegen den Verkaufskriterien einen weißen Belag auf Äpfeln verursachte, haben wir 2018 die ausgebrachte Menge reduziert (0,242 l/hl = 200 g S/hl) und 2019 Thiopron® durch ein anderes gängiges Schwefelprodukt (mikrofeinen Schwefel) ersetzt ), Thiovit® (Syngenta Italia spa). Thiovit® wurde entsprechend der empfohlenen Dosierung (240 g/hl = 190 g S/hl) ausgebracht. Diese Umstellung auf ein anderes Schwefelprodukt hatte keinen grundsätzlichen Einfluss auf unsere Ergebnisse, da die Auswirkung auf die Blattfleckenbildung unabhängig von der Schwefelart/dem Schwefelprodukt ist (siehe ergänzende Abbildung 13). Alle zuvor beschriebenen Behandlungen nennen wir „Blattdünger auf Schwefelbasis“ (SBF). Die Anwendungshäufigkeit pro Saison betrug für Golden Delicious 4 Anwendungen im Jahr 2017 und 5 Anwendungen in den Jahren 2018 und 2019. Für „Cripps Pink“ betrug die Anwendungshäufigkeit 6 Mal pro Saison in allen drei Jahren (2017–2019; siehe Ergänzungstabelle 1). Alle Behandlungen wurden mit einem experimentellen Obstgartensprühgerät (Axialgebläse, Injektordüsen) mit einer verbrauchten Wassermenge von 15 hl/ha durchgeführt.

Um die Wirksamkeit des SBF mit der aktuellen Praxis zu vergleichen, haben wir auch Behandlungen überwacht, bei denen mehrere Fungizide zur Bekämpfung von Alternaria-Blattflecken und Fruchtflecken eingesetzt wurden. Wir haben zwei Wirkstoffe mit zwei unterschiedlichen Wirkungsweisen an „Golden Delicious“ getestet: (I) Kaliumphosphonat (FRAC-Code: P 07; 2017: „FosfiD’oR 250“, Orius; 2018–2019: „Century Pro“, BASF ) und (II) Difenoconazol (FRAC-Code: 3; 2017–2019: „Score 10 WG“, Syngenta). Die angewendeten Dosierungen waren: FosfiD'oR 250: 3 l/ha (45,3 % Kaliumphosphonat), Century Pro: 1,9 l/ha (50,4 % Kaliumphosphonat), Score 10 WG.: 750 g/ha (10 % Difenoconazol). Jedes dieser Fungizide wurde separat getestet. Da „Cripps Pink“ eine wesentlich längere Wachstumsphase hat (Ernte im November) und die Anwendungshäufigkeit durch gesetzliche Vorschriften für jeden Wirkstoff auf eine bestimmte Anzahl begrenzt ist, haben wir eine Fungizid-Mix-Behandlung getestet. Der Fungizid-Mix umfasste folgende Fungizide: Syllit® 65 (UPL), mit 1,38 kg/ha (65 % Dodine), Polyram® DF (BASF), mit 2,6 kg/ha (70 % Metiram), Geoxe ® (Syngenta), mit 0,45 kg/ha (50 % Fludioxonil). Alle Fungizide wurden gemäß guter landwirtschaftlicher Praxis angewendet, in der Regel nach Regenfällen, wenn das Risiko einer Pilzinfektion hoch ist. Die Behandlungshäufigkeit mit Fungiziden pro Vegetationsperiode betrug für „Golden Delicious“ 2017: 8, 2018: 5, 2019: 11 und für „Cripps Pink“: 2017: 11, 2018: 7, 2019: 8. Für Statistiken: Ergebnisse aller Fungizidparzellen wurden einbezogen und stellen somit eine durchschnittliche Wirkung verschiedener Fungizide dar („Golden Delicious“: 2 Wirkstoffe; „Cripps Pink“: 4 Wirkstoffe).

Im Rahmen unseres Feldversuchs (Versuchsaufbau wie oben beschrieben) haben wir 2017 zusätzlich die Wirkung verschiedener Blattdünger und Düngerkonzentrationen auf Blattflecken getestet. Verwendete Düngemittel waren: Thiopron® (UPL Italia srl), Fytofert® S (Desangosse Italia srl), Sulfatmischung (siehe Tabelle S1). Alle drei Düngemittel wurden in zwei unterschiedlichen Konzentrationen ausgebracht, die stets korrigiert wurden, um eine Endkonzentration von 50 g Schwefel hl−1 und 500 g Schwefel hl−1 zu erhalten (Thiopron®: 61 ml hl−1 und 606 ml hl−1, 68 ml hl−1 und 685 ml hl−1, Sulfat-Mix: 500 g S hl−1 wie in Tabelle S1 beschrieben, für 50 g S hl−1 haben wir MgSO4 auf 318,8 g hl−1 reduziert.

Um zu testen, ob der Sulfat-Mix (S-Mix, siehe Ergänzungstabelle 1) eine fungizide Wirkung auf Alternaria spp. hat, haben wir im Labor ein Screening der fungiziden Aktivität durchgeführt. Dazu verwendeten wir 6 × 4 Mikrotiterplatten, in die wir PDA als Kontrolle einfüllten, PDA mit S-Mix (PDA + S-Mix) in seiner Feldkonzentration (siehe oben) vermischten und PDA S-Mix mit 1 mischte 10 % der verwendeten Konzentration (PDA + 1/10 S-Mix). Alle drei Medien (PDA, PDA + S-Mix, PDA + 1/10 S-Mix) wurden mit vier verschiedenen Alternaria-Isolaten (A02/F172, A02/F152, A15/271, A15/31) mit jeweils drei Replikaten beimpft ( 9 Vertiefungen pro Isolat). Nach der Inokulation wurden die Platten in einen Inkubator bei 25 °C überführt. Das Myzelwachstum (Durchmesser, mm) wurde nach 24 Stunden mit einem Lineal gemessen und mit der Kontrolle (PDA) verglichen. Von jedem Replikat wurde der Durchmesser mit zwei Messungen in orthogonaler Anordnung (technische Replikate) bestimmt. Das Myzelwachstum wurde nicht um 1/10 S-Mix und S-Mix in den Medien (PDA) reduziert, sondern leicht erhöht (p < 0,001; ergänzende Abbildung 13). Die Wechselwirkungen zwischen den Medien (Konzentration) und den Isolaten waren signifikant (p = 0,007), da das Wachstum eines Isolats (A02/F172) keine Unterschiede zwischen den Konzentrationen aufwies. Somit hat S-Mix keine fungizide Wirkung.

Für die Nährstoffanalyse haben wir im Rahmen unseres Feldversuchs (2017 bis 2019) Blätter aus verschiedenen Parzellen/Behandlungen entnommen. Im Laufe der drei Jahre haben wir für „Golden Delicious“ etwa 9900 Blätter von 891 Bäumen aus 99 Parzellen beprobt, für „Cripps Pink“ waren es 9100, 819 bzw. 91. Wir haben alle von einer Parzelle gesammelten Blätter zusammengefasst, sodass jede Parzelle eine Pflanze darstellt replizieren und einen Datenpunkt in der anschließenden statistischen Analyse verwenden. Alle Blätter wurden wie oben beschrieben auf Blattflecken untersucht und anschließend auf die Nährstoffkonzentration analysiert. Dazu wurden Blätter (100 pro Parzelle) in einem Ofen bei 60 °C für mindestens 72 Stunden in einem Trockenschrank getrocknet und die Blattstiele vor der Analyse entfernt. Die chemische Analyse wurde vom Labor für Boden- und Pflanzenanalytik Laimburg (akkreditiert nach ISO 17025:2005) durchgeführt. Stickstoff wurde mit einem Elementaranalysator nach DIN EN ISO 16634-1:2009 (nach Dumas) analysiert. Andere Nährstoffe (P, K, Ca, Mg, B, Fe, Mn, Cu, Zn, S) wurden mit optischer Emissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES) gemäß EPA 3052 1996 + EPA 6010D 201 analysiert. Alle angegebenen Nährstoffkonzentrationen sind pro „Trockengewicht“.

Apfelplantagen können hinsichtlich der Prävalenz von Alternaria-Blattflecken- und Fruchtfleckenbefall dramatische Unterschiede aufweisen, selbst wenn Obstplantagen in unmittelbarer Nähe liegen und von derselben Apfelsorte stammen. Um unsere Blattnährstoffanalyse zu validieren, haben wir vier „Golden Delicious“-Obstgartenpaare ausgewählt. Um den Einfluss der Bewirtschaftung zu minimieren, wurden die Obstgartenpaare auf der Grundlage von zwei Kriterien ausgewählt: (I) Jedes Paar wurde von demselben Landwirt (drei Landwirte) bewirtschaftet und (II) jedes Obstgartenpaar bestand aus einem Obstgarten, der die letzten ~ 5 zeigte Jahren kein oder nur minimaler Befall und ein Obstgarten, der durch regelmäßig sehr starken Befall gekennzeichnet ist (natürliche Häufigkeit). Ein Paar erfüllte Kriterium I) nicht, da wir die Laimburger Streuobstwiesen mit einer externen Streuobstwiese paarten. Von jedem Obstgarten wurden im Jahr 2018 dreimal (25. Mai, 20. Juli, 7. September) und im Jahr 2019 zweimal (17. Mai, 9. Juli) Blätter beprobt, mit zwei Wiederholungen pro Obstgarten und Zeitpunkt und 50 Blättern von 15 Bäume pro Replikat. Am ersten Probenahmetermin (25. Mai 2018) nahmen wir drei Wiederholungen pro Obstgarten. Die Blätter wurden wie oben beschrieben auf ihre Nährstoffkonzentration analysiert.

Alle in der Studie verwendeten Isolate stammten aus der Pilzkultursammlung Laimburg und wurden zunächst aus Apfelblattflecken und Fruchtflecken in verschiedenen Obstgärten in Südtirol, Italien, isoliert. Die phylogenetische Klassifizierung der Isolate wurde mit der von Armitage et al. vorgeschlagenen Methode bestimmt. im Jahr 2015 und die Ergebnisse zeigten, dass zwei Isolate zu A. alternata sspp. gehörten. tenuissima, während die verbleibenden zwei Isolate zu A. alternative sspp. gehörten. arborescens.

PDA-Platten (zwei pro Isolat) wurden mit Alternaria-Isolaten aus der Laimburger Sammlung beimpft und in einem Inkubator bei 25 °C aufbewahrt. Nach einer Woche schnitten wir einen 1,5 cm3 großen Würfel aus dem gewachsenen Myzel und zermahlen ihn in einem Mörser mit 200 µl steriler 0,03 % Tween-Lösung. Nachdem das Myzel vollständig zermahlen war, gaben wir 4,8 ml Tween-Lösung in den Mörser. 750 µl der Myzelsuspension wurden auf V8-Platten (4 Platten pro Isolat) pipettiert, die zuvor mit getränkten (sterilen Wasser) Zellophanscheiben abgedeckt wurden. Geschlossene Platten (Parafilm) wurden in einer Klimakammer bei 25 °C und einem Lichtprogramm aus 8 h Schwarzlicht (Philipps TL-D 36W BLB 1SL/25) und 16 h Dunkelheit aufbewahrt. Nach 3 Wochen wurde die Zellophan-Myzel-Schicht mit einer Pinzette entfernt und zusammen mit 8 ml der Tween-Lösung in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen gegeben (zwei Platten pro Röhrchen). Falcons-Röhrchen wurden eine Minute lang gevortext, 5 Minuten lang in ein Ultraschallbad (40 kHz) gestellt und erneut 1 Minute lang gevortext. Um das Myzel von den Sporen zu trennen, wurde der Inhalt der Falkenröhrchen anschließend gefiltert (80 µm Maschenweite) und der resultierende flüssige Teil mittels Hämozytometer (Fuchs-Rosenthal-Zählkammer) auf die Sporendichte analysiert. Alle Sporensuspensionen wurden auf eine Enddichte von 1,25 × 106 Sporen/ml verdünnt.

Mit diesem Experiment wollten wir den Einfluss verschiedener Blattverletzungen auf die Infektion mit Alternaria spp. testen. Es gab vier verschiedene Arten der Behandlung von Blattschäden: „keine“ = gesundes Gewebe, „1 Stunde vorher“ = Verletzung mit einer Kombizange eine Stunde vor der Inokulation, „7 Tage vorher“ = Verletzung mit einer Kombizange 7 Tage vor der Inokulation, „Milben“ = Blätter, die am Tag der Inokulation in einem Obstgarten gesammelt wurden, der derzeit stark von der Europäischen Roten Vogelmilbe (Panonychus ulmi) befallen ist. Diese gesammelten Blätter wiesen einen sichtbaren Milbenschaden auf. Alle Blätter wurden im Obstgarten des Forschungszentrums Laimburg gesammelt, mit Ausnahme der von Milben befallenen Blätter eines nahegelegenen Bauernhofs (ca. 3 km Entfernung).

Bei der Verletzungsart „7 Tage vorher“ wurden 7 Tage vor Versuchsbeginn die Blätter von „Golden Delicious“ mit einer Zange an den Bäumen markiert und verletzt. Die verletzten Blätter, die gesunden Blätter und die durch Milben geschädigten Blätter wurden am Morgen der Versuchsimpfung (29. Mai 2019) gesammelt und zum Schneiden von Blattscheiben mit einem Korkbohrer (15 mm Durchmesser) verwendet. Vier Scheiben pro Blatt wurden zufällig geschnitten, wobei die Einbeziehung der Mittelrippe vermieden wurde. Um das mögliche Vorhandensein anderer Krankheitserreger und Schimmelpilze zu reduzieren, wurden die Scheiben jeweils zwei Sekunden lang in 3 %ige Natriumhypochloritlösung und in 70 %ige Ethanollösung getaucht und 10 Sekunden lang in sterilem Wasser gewaschen. Blattscheiben des Verletzungstyps „1 h vorher“ wurden anschließend mit einer Zange verletzt. Wir haben vier verschiedene Isolate ausgewählt, die zu den Kladen A. alternata sspp. gehörten. tenuissima (A18/F01/14, A18/F03/09) und zwei A. alternata sspp. arborescens (A18/F05/11, A18/F10/14; nach Armitage et al.75) Isolate wurden ursprünglich aus verschiedenen befallenen Obstgärten Südtirols isoliert. Unser Versuchsaufbau war ein vollständig gekreuztes Design der Faktoren „Art der Verletzung“ und des Faktors „Isolate“, jeweils mit vier verschiedenen Isolaten, was zu 16 Behandlungskombinationen führte. Wir verwendeten vier Replikate für jede Behandlungskombination (vier Petrischalen), bestehend aus vier technischen Replikaten (vier Scheiben pro Platte).

Kleine Petrischalen (55 mm Durchmesser) wurden mit einer Schicht autoklavierter Glasperlen (3 mm Durchmesser) und sterilem Wasser (3 ml) gefüllt, bis die Perlen bedeckt waren. In jeden Teller legen wir 4 Blattscheiben ein, entsprechend der gleichen Behandlung. Den vier Isolaten entsprechend hatten wir vier verschiedene Sporensuspensionen, von denen wir 60 µl mit einer Pipette auf die Verletzung jeder Blattscheibe (Mitte) auftrugen. Als Kontrolle (n = 4) verwendeten wir steriles Wasser, das wir wie oben auf Blattscheiben jeder „Verletzungsart“ auftrugen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass jede Petrischale Blattscheiben einer „Art der Verletzung“ und ein Isolat oder reines Wasser enthielt (Kontrolle; insgesamt 5 Behandlungen × 4 Isolate × 4 Replikate = 80 Schalen). Anschließend wurden Petrischalen in eine Klimakammer (Proclimatic ACLIL 900 Lt) bei 25 °C, 65 % relativer Luftfeuchtigkeit und einem Lichtprogramm entsprechend der gleichzeitigen Tageslänge (15,5 h hell/8,5 h dunkel, 5000 lx) gestellt. Aufgrund des Verdunstungsverlusts fügten wir am 3., 6. und 9. Tag 2 ml steriles Wasser zu jedem Teller hinzu.

Nach 13 Tagen (12. Juni 2019) wurde jede Scheibe gemäß den folgenden Klassen [% nekrotische Fläche] auf nekrotische Blattflecken untersucht: 0, 0–1, 1–5, 5–10–10–15, 15–20, 20–30, > 30. Die Umwandlung in numerische Daten erfolgte wie oben beschrieben (Hauptfeldexperiment). Hinweis: Wir haben die Veränderung der nekrotischen Fläche im Vergleich zur nekrotischen Fläche der entsprechenden Kontrollen ausgewertet, die sich bereits vor der Inokulation aufgrund der unterschiedlichen „Art der Verletzung“-Behandlungen unterschieden.

Reife „Golden Delicious“-Äpfel wurden am 18. September 2019 im Forschungszentrum Laimburg geerntet. Im Labor wurde die Apfeloberfläche mit in 70 %iger Ethanollösung getränkten Papiertüchern gereinigt. Mit einem Markierstift wurde die Apfeloberfläche in drei gleich große Kugelsegmente unterteilt. Jedes Segment wurde einer der drei Verletzungsarten (Behandlung, n = 4) zugeordnet: Nadel = mit Spritzennadel verletzt (5 Einstiche ~ 5 mm tief), Sandpapier = mit Sandpapier verletzt (~ 6 cm2 verletzter Apfel). Oberfläche), Keine = unbehandeltes gesundes Gewebe. Mittels einer Bürste wurden die verletzten Stellen und das gesunde Gewebe mit einer Sporensuspension (Isolat A18/F10/14, A. alternata sspp. arborescens) beimpft. Als Kontrolle verwendeten wir steriles Wasser, das wir analog als Sporensuspension auf vier weitere Äpfel mit den gleichen Verletzungstypen auftrugen. Die Äpfel wurden in eine Plastikbox mit wassergetränkten Papiertüchern auf dem Boden gelegt, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen. Die Äpfel wurden auf ein Metallgitter in der Kiste gelegt, um die Äpfel trocken zu halten. Die Boxen wurden mit einem Deckel (nicht luftdicht) abgedeckt und in eine Klimakammer (Proclimatic ACLIL 900 Lt, 25 °C, 65 % relative Luftfeuchtigkeit) und ein Lichtprogramm entsprechend der gleichzeitigen Tageslänge (12 Stunden hell/12 Stunden dunkel) gestellt. Am 4. und 8. Tag wurde Wasser nachgefüllt, um die Handtücher nass zu halten. Nach 12 Tagen wurden die Äpfel wie zuvor auf Fruchtflecken und Nekrosebildung kontrolliert.

Wir wollten testen, ob (a) Fruchtflecken während der Lagerung an Zahl und Größe zunehmen und (b) ob gesunde Äpfel während der Lagerung durch infizierte Äpfel in der Nähe infiziert werden können. Dafür wurden „Golden Delicious“-Äpfel im September (gemeinsamer Erntetermin) in einem Obstgarten mit starkem Alternaria-Früchtenfleckenbefall (Mittelwert: 10 Flecken pro Apfel) geerntet. Gesunde Äpfel wurden von einem anderen Obstgarten ohne Befall entnommen. Gesunde Äpfel ohne Fruchtflecken wurden zusammen mit den infizierten Äpfeln in Plastikboxen gelegt (27.09.2000). Beide Kartons wurden bei Raumtemperatur (15–20 °C) gelagert, einer bei 65 % relativer Luftfeuchtigkeit (10 befallene, 15 gesunde Äpfel) und der andere bei 100 % relativer Luftfeuchtigkeit (11 befallene, 10 gesunde Äpfel). Nach zwei Monaten (25.11.2000) wurden die Äpfel erneut auf Fruchtflecken untersucht und mit denen vor der Lagerung verglichen.

Um zu testen, ob Alternaria spp. Nekrotisches Gewebe besiedelt, wir haben auf dem Feld künstlich nekrotische Blattflecken hervorgerufen. Dazu wurde das Herbizid Spotlight® Plus (Belchim; Carfentrazone-ethyl; Konzentration: 3 ml/L) mittels Handsprühgerät auf die Blätter von „Golden Delicious“ im Obstgarten Laimburg gesprüht. Sechs Bäume pro Parzelle (n = 4) wurden am 8. Juli 2019 im Rahmen unseres Hauptfeldversuchs behandelt. Die resultierenden künstlichen Blattflecken waren deutlich von natürlichen Blattflecken zu unterscheiden. Am 3. September und 14. Oktober 2019 wurden fünf Blätter pro Parzelle mit deutlichen Symptomen von den mit Herbiziden behandelten Parzellen und den Kontrollparzellen mit natürlichem Blattfleck gesammelt. Gesammelte frische Blätter wurden mit einem Kopiergerät gescannt, um Farbbilder (300 dpi) zu erstellen. Basierend auf den Farbbildern haben wir mithilfe der ImageJ-Software84 die Größe (cm2) des nekrotischen Flecks bestimmt. Nach dem Scannen wurden die Blätter in Papiertüten mindestens 72 Stunden lang bei 60 °C in einem Trockenschrank getrocknet. Anschließend wurden die Sporen wie folgt aus den getrockneten Blättern gewaschen: Getrocknete Blätter einer Parzelle wurden zerkleinert und zusammen in ein 200-ml-Becherglas mit jeweils 60 ml entionisiertem Wasser gefüllt. Die Becher wurden 2 Minuten lang (200 U/min) geschüttelt, anschließend drei Minuten lang in ein Ultraschallbad (40 kHz) überführt und erneut 5 Minuten lang (200 U/min) geschüttelt. Die Wasser-Blatt-Mischung wurde filtriert (80 µm Mesh) und das resultierende Filtrat zur Analyse der Sporendichte mittels eines Hämozytometers (Fuchs-Rosenthal-Zählkammer) verwendet.

Die folgenden Analysen basierten auf linearen Mixed-Effects-Modell-Analysen (LMM). Alle Analysen wurden in R Version 4.0.2 (R Core Team, 2019) durchgeführt. Random Forest-Analysen wurden mit der randomForest-Paketversion 4.6-1485 durchgeführt. Lineare gemischte Modelle wurden mit der NLME-Version 3.1-148 angepasst und die Hauptkomponentenanalyse wurde mit der veganen Paketversion 2.5-686,87 durchgeführt.

Für die grafische und statistische Analyse wurden die ordinalen Blattflecken- und Fruchtfleckendaten in kontinuierliche Daten (Prozentsatz) umgewandelt, indem anhand der Klassenmittelpunkte die gewichteten Mittelwerte (mittlere nekrotische Fläche [%], mittlere Anzahl an Fruchtflecken pro Apfel) berechnet wurden jede Baumseite eines Grundstücks. Die Reduzierung von Blattflecken und Fruchtflecken wurde wie folgt berechnet: (Mittlere Behandlung der nekrotischen Fläche / Mittlere Kontrolle der nekrotischen Fläche)-1)*100.

Die Wirkung von SBF und Fungiziden (Behandlungen) auf Blattflecken und Fruchtflecken wurde für jede der beiden Behandlungen und jede Apfelsorte („Golden Delicious“ und „Cripps Pink“) separat analysiert. Als Antwortvariablen wurden „Nekrotische Blattfläche“ (%) und „Anzahl der Fruchtflecken“ (# Frucht-1) verwendet. Der feste Effekt war „Behandlung“ (SBF vs. Kontrolle oder Fungizid vs. Kontrolle). Da wir Daten aus mehreren Jahren hatten, haben wir „Jahr“ (2017–2019) und Block (Replizieren; n = 4) als verschachtelte Zufallseffekte mit separaten Steigungen (Jahr | Block) angegeben.

Um zu testen, ob die Anfälligkeit für Alternaria-Blattflecken mit der Nährstoffkonzentration (Mg, Mn, S) zusammenhängt, verwendeten wir LMMs mit Mg-, Mn- und S-Konzentration als Antwortvariablen. Als fester Effekt wurde „Obstgartentyp“ (hohe vs. niedrige Prävalenz) festgelegt. „Datum“ (n = 5, mit jeweils 2 Wiederholungen pro Obstgarten) und „Orchard ID“ (2018: n = 8; 2019: n = 6) wurden als Zufallseffekt mit separaten Steigungen (Datum|Orchard ID) angegeben.

Als abhängige Variable wurde die „Sporendichte“ von Alternaroid-Sporen, die aus künstlich (Herbizid) hervorgerufenen Blattflecken und natürlichen Blattflecken gewonnen wurden, festgelegt. Feste Effekte waren „Blattnekrosetyp“ (künstlich vs. natürlich) und „Datum“ der Blattsammlung (3. Sept. 2019 vs. 14. Okt. 2019) mit deren Wechselwirkung. „Blockieren“ (Replizieren; n = 4) wurde als Zufallseffekt festgelegt.

Als abhängige Variable verwendeten wir die relative nekrotische Blattfläche der Blattscheiben. Die Werte für jedes Replikat stellen den Mittelwert der entsprechenden technischen Replikate dar (n = 4). „Art der Verletzung“ („keine“ vs. „eine Stunde vorher“ vs. „7 Tage vorher“ vs. „Milben“) und „Isolieren“ (A18/F01/14 vs. A18/F03/09 vs. A18/F05 /11 vs. A18/F10/14) wurden als feste Effekte festgelegt, ebenso wie deren mögliche Wechselwirkung. Als Zufallseffekt wurde „Replizieren“ (n = 4) angegeben.

Um die Blattnährstoffkonzentrationen mit der Blattfleckenprävalenz in Verbindung zu bringen, haben wir Random-Forest-Analysen für die Sorten Golden und Pink separat durchgeführt88. Für jeden Wald haben wir 10.000 Bäume gezüchtet und dabei 4 Prädiktoren für die Aufteilung an jedem Knoten zufällig ausgewählt. Die Variablen wurden nach ihrer mittleren Abnahme der Knotenverunreinigung, gemessen anhand der Restquadratsummen, eingestuft, und diejenigen mit einem unverhältnismäßigen Einfluss wurden nach visueller Inspektion für die weitere Analyse ausgewählt.

Anschließend wurden die ausgewählten Nährstoffe in insgesamt linearen gemischten Modellen verwendet, um ihre Auswirkungen auf die (logarithmisch transformierte) Schwere der Blattfleckenbildung bei den beiden Sorten zu testen und so die statistische Aussagekraft zu maximieren. Zufällige Effekte wurden einbezogen, um wiederholte Beobachtungen auf denselben Parzellen über Jahre hinweg zu berücksichtigen. Zu den festen Effekten gehörten die Sorte, die ausgewählten Blattnährstoffe und die wechselseitigen Wechselwirkungen zwischen jedem Blattnährstoff und jeder Sorte. Letzteres ermöglicht bei jeder Sorte ein unterschiedliches Verhältnis zwischen den einzelnen Nährstoffen und Blattflecken. Es lagen zu wenige Daten vor, um weitere Wechselwirkungen zwischen Nährstoffen zu untersuchen.

Zwei der ausgewählten Prädiktoren (S und Mg) waren stark kollinear (ergänzende Abbildung 4) und die Einbeziehung beider in dasselbe Modell führte zu instabilen Schätzungen der Regressionskoeffizienten. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir zwei Ansätze gewählt. Zunächst führten wir eine Hauptkomponentenanalyse nur für die S- und Mg-Daten durch. Die erste Achse erklärte erwartungsgemäß den größten Teil der Variation (90,1 %) in diesen beiden Elementen. Anschließend wurden die PCA-Achsen-Scores (1 und 2) als Prädiktoren im LMM (mod1, Ergänzungstabelle 5) verwendet, um gleichzeitig die Auswirkungen von S und Mg auf Blattflecken zu erfassen. Zweitens haben wir zwei LMMs ohne Mg (mod2) oder S (mod3) als Prädiktoren angepasst und die Modellanpassung basierend auf AIC-Werten verglichen89. Wir haben das Best-Fit-Modell (mod2) mithilfe von Likelihood-Ratio-Tests (mod2a) weiter vereinfacht.

Die in dieser Studie verwendeten Pflanzenmaterialien stammten aus kontrolliertem Anbau und die gesamte Sammlung erfolgte in Übereinstimmung mit institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für die Sammlung von Wildpflanzen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind frei zugänglich unter: https://doi.org/10.5281/zenodo.7963642.

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Wir danken Markus Kelderer, Claudio Casera, Thomas Facchini, Gazmend Arslani und Bekir Musliu für die Unterstützung vor Ort, Michaela Bertagnoll und Sabine Oettl für die Unterstützung im Labor und der Bereitstellung/Identifizierung der Isolate. Vielen Dank an Yazmid Reyez Domingues für die Pilzdiagnose und die Diskussion. Wir danken Martijn Bezemer und Emilia Hannula für die kritische Lektüre früherer Entwürfe. Die Studie wurde vom Apfelkonsortium Südtirol (Terlan/Italien) gefördert (Prot. Nr. VZL.00/5881/85.00/MO-cg). ERJW wurde durch einen NWO-Rubicon Mobility Grant (Niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung, Vertragsnummer 019.181EN.01) unterstützt.

Terra Institut, Säbenertorgasse 2, 39042, Brixen, BZ, Italien

Ulrich E. Prechsl, Werner Rizzoli & Klaus Marschall

Gruppe Nachhaltige Agrarökosysteme, Institut für Agrarwissenschaften, Departement Umweltsystemwissenschaften, ETH Zürich, Universitätstrasse 2, 8092, Zürich, Schweiz

ER Jasper Wubs

Abteilung für terrestrische Ökologie, Niederländisches Institut für Ökologie (NIOO-KNAW), Postfach 50, 6700 AB, Wageningen, Niederlande

ER Jasper Wubs

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UEP entwarf, implementierte und bewertete alle Experimente, mit Ausnahme des Obstlagerungsexperiments, bei dem KM diese Rolle übernahm. WR war an der Konzeption und Durchführung der Feldversuche (Feldbehandlungen) beteiligt und führte Langzeittests (>15 Jahre) von Alternaria-Fungiziden durch. UEP und ERJW führten die Datenanalyse durch und verfassten das Manuskript. Alle Autoren gaben konstruktive Kommentare zum Manuskript ab.

Korrespondenz mit Ulrich E. Prechsl.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Prechsl, UE, Rizzoli, W., Marschall, K. et al. Die fungizidfreie Behandlung von Alternaria-Blattflecken und Fruchtflecken auf Äpfeln weist darauf hin, dass Alternaria spp. als Sekundärkolonisator. Sci Rep 13, 8431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35448-2

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Eingegangen: 10. Januar 2023

Angenommen: 18. Mai 2023

Veröffentlicht: 24. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35448-2

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